歡迎訪問北京德博生物技術有限公司官方網站!

Western Blot問題指南(一)

1. 參考書推薦

A. 對初學者看什么資料比較好?
解答:《抗體技術實驗指南》和Antibodies(a laboratory manual, wrote by Ed Harlow ,david lane)兩本書不錯。

2. 針對樣品的常見問題

B. 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot (以下簡寫成Western Blot),提取線粒體后凍存(未加蛋白酶抑制劑),用的博士德的一抗,開始還有點痕跡,現在越來越差,上樣量已加到120μg,換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?

解答:懷疑是樣品問題,可能是:1,樣品不能反復凍融;2,樣品未加蛋白酶抑制劑。同時,建議檢查Western Blot過程, 提高一抗濃度。對于加蛋白酶抑制劑來說,一般加PMSF就可以了,最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

C. 同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎?

解答:當然可以,有的甚至可以同時測幾十種樣品。

D. 如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白,操作需要注意什么?

解答:如果是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑就要溫和得多,這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

E 我的樣品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在轉膜時經常會發現只有一部分蛋白轉到了膜上,就是在轉膜后染膠發現有的孔所有的蛋白條帶都在,只是顏色變淡了,有什么辦法可以解決?

解答:你可以加大上樣量,沒有問題,還有轉移時你可以用減少電流延長時間,多加5-10%甲醇。

F. 想分離的蛋白是分子量260kd的,SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適?積層膠的濃度又該用多少?這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎?

解答:260kd的蛋白不好做, 分離膠用6%, Stacking Gel 3.5%。

G.  如果上樣量超載,要用什么方法來增加上樣量?如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚。

解答:可以濃縮樣品,也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超載30%是不會有問題的。如果已經超了不少了,而且小分子量的也要,可以考慮加大膠的厚度,可以試試1.5mm的 comb。

H.  蛋白變性后可以存放多久?

解答:-80℃,一兩年沒有問題。最關鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。

I.  我所測定的蛋白分子量是105KD,按理說分離膠應當采用7.5%,但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11%的配方,不知為何?

解答:上述您提到的兩種凝膠均可以使用,因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內,但需注意條帶位置。

J. 接下來我準備采用DAB顯色技術,二抗是生物素化的多克隆抗體,三抗是親和素生物素體系,不知采用這樣的方案后,封閉液是否要作調整,能否再用5%的脫脂奶粉呢?好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成,是嗎?

解答:不能使用脫脂奶粉,因為脫脂奶粉中含生物素,用BSA代替應該好一點.

K. 還有一問題,一般一次上樣的蛋白總量是多少,跟目的蛋白的表達量有關系嗎?

解答:Western Blot一般上樣30-100微克不等,結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時間都有關系,也與顯色時間長短有關。開始摸條件時,為了拿到陽性結果,各個步驟都可以量多一點時間長一點,當然背景也就出來了。要拿到好的結果,如果抗體好的話比較容易,抗體不好的話就需要反復地試了,當然有的不適 合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結果不容易。

L. 做組織樣品的western的時候,處理樣品有什么訣竅嗎?還有,您用過大牛血清做封閉劑嗎?濃度如何?效果是不是比BSA好一點?

解答:必須進行研磨、勻漿、超聲處理,蛋白質溶解度會更 好,離心要充分,膜蛋白需用更劇烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強,需要注意抑制蛋白酶的活 性(加入PMSF和蛋白酶抑制劑 cocktail),封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用。如果一抗為多克隆抗體,使用BSA也是不錯的選擇。

M. 您是否可以介紹一下大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?

解答:做200kd蛋白的Western Blot時要注意,分離膠最好選擇>7%的;剝膠時要小心;轉移時間需要相應延長;要做分子量參照(否則出現雜帶不知道如何分析)。

N. 有什么方法可以提高上樣量?

解答:可以濃縮樣品;增大上樣體積來增大上樣量。

0512-62512025

获取股票历史数据