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免疫熒光單標記和雙標記的方法

l免疫熒光單標記方法
免疫熒光單標記是指只標記一種蛋白質分子,方法比較簡單,只要按照染色步驟去做,通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇,固定液選擇的合適與否,可能會直接影響染色結果。具體染色方法如下。
1)所需材料與試劑
(1)培養在蓋玻片或玻璃培養皿中融合程度達到60%一70%的細胞。
(2)一抗、FITC或TRITC標記的二抗。
(3)4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃預冷20min)。
(4)封閉液。
(5)0.01mol/LPBS緩沖液。
2)染色方法
(1)取出培養有細胞的蓋玻片或glass—bottom培養皿,用0.01MPBS洗2—3遍。
(2)加入0.3%的TritonX—100,37℃,30rain。
(3)加入4%多聚甲醛室溫固定30min或冷丙酮4℃固定10min。
(4)正常阻斷血清1:20封閉室溫20~30min,抑制IgG的非特異性結合。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。
(5)去掉正常血清,直接加入一抗,37C孵育1h或4℃過夜。抗體以0.01mol/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經試驗而定)。
(6)0.3%TritonX—100洗5min,0.01mol/IPBS洗5min,0.3%TritonX 5min,0.01MPBS洗5rain。
(7)加入FITC—二抗或TRITC—二抗,37℃,孵育1h。
(8)0.3%TritonX—100洗5rain,0.01mol/LPBS洗5min,0.3%TritonX 5min,0.01mol/LPBS洗5mln,用濾紙吸干。
(9)90%甘油(PBS配制)封片。
(10)激光掃描共焦顯微鏡下觀察,或于4℃避光保存。
2.免疫熒光雙標記方法
免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內兩種蛋白質分子,當懷疑某種配體與已知受體結合后可用此方法加以證明。此方法稍微復雜一些,首先應注意所用的一抗必須是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如:A抗體為多克隆抗體,來自家兔;B抗體為單克隆抗體,來自小鼠)。其次,兩種二抗所帶熒光素的發射光不應重疊,且盡量遠離,通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5,或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下,染色時兩種一抗可以同時孵育,然后可以同時孵育兩種二抗。但當染色結果一種顏色非常弱,而另一種顏色比較強時,應考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標記。
3.樣品制備注意事項
(1)在進行免疫熒光標記時,如樣品的來源為組織,應采用冷凍切片。
(2)樣品制備應滿足一般熒光顯微鏡觀察的要求。
(3)盡量去除非特異性熒光信號。細胞經熒光染色后可能會產生自發熒光,可用PBS取代一抗作為對照,以區分自發熒光和陽性結果。
(4)為了不將細胞壓扁,蓋玻片與載玻片之間的介質多用甘油與PBS混合液(9:1)封片,甘油還有抗熒光淬滅的作用。同時還應注意封片時避免產生氣泡。
(5)用指甲油將蓋玻片四周封片,注意避免將細胞壓扁。
(6)為防止熒光淬滅,可在介質中加入抗氧化劑DABCO(100mg/mi),室溫,密封可保存6個月;或苯二胺(100mg/mi),-20℃,保存2~3周。

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